辅助生殖技术的研究进展

摘要：辅助生殖技术(assisted reproductive technologies，ART)是为生殖功能障碍的夫妇提供的各种非自然辅助他们生殖的技术。试管婴儿就是使用该技术的体外受精———胚胎移植方法生育的婴儿。本文就对目前常用的辅助生殖技术人工授精、体外受精与胚胎移植(IVF．ET)、卵泡浆内单精子显微注射（ICSI）、植入前遗传学诊断(PGD)、赠卵IVF-ET和精子的保存等方法的发展来综述辅助生殖技术的研究进展。

据世界卫生组织（WHO）评估，每7对夫妇中约有1对夫妇存在生殖障碍。我国近期调查，国内不孕症者占已婚夫妇人数的10%，比1984年调查的4.8%增加一倍多，发病率呈上升趋势。我国更受传宗接代观念影响，多数家庭盼子心切，使不育夫妇承受着极大的心理压力，甚至引发离异、婚外恋之类家庭乃至社会的问题。ART的直接效应是使不育夫妇实现妊娠生子的愿望，由不育引发的相关问题自然会随之得到解决。临床统计，不育患者中约20%的夫妇，不借助ART就根本无法生儿育女。

生殖的中心环节是受精，因此受精方法的研究和进步是辅助生殖技术发展的一条主线。人工授精是用非性交方法，将精子置入女性生殖道内，使精子和卵子在体内结合、受精、妊娠的方法。人工授精具有悠久的历史，是最早应用的助孕技术。公元二世纪Talmud已提出人工授精的可能性，1761年，Spallanzi成功地为母马人工授精，1790年．John Hunter为严重尿道下裂患者的妻子行配偶间人工授精(artificial insemination withhusband’s sperm，AIH)获得成功，1844年William Pancoast首次施行非配偶间人工授精(arti．ficial insemination bv donor，AID)获得成功，1954．年Bunge首次成功地用冷冻精子作AID获得成功， 1986年Forrler报告腹腔人工授精(direct in．traperitoneal insemination，DIPI)获得成功。

人工授精只是在体内的精子、卵子结合受精，临床应用有它的局限性，而且难以对受精的过程进行人为的影响。体外受精方法的成功才使得辅助生殖技术根本性地进步和发展。

对哺乳动物体外受精与胚胎移植研究，为人类体外受精与胚胎移植的成功打下了良好的基础。华裔生物学家张明觉在1945年开始做家兔体外受精试验[4]，1950年提出了精子获能问题，Austin在20世纪50年代初发展完善了精子获能的理论，这一理论为体外受精试验成功起到了促进作用。1959年张明觉的家兔体外受精试验成功，并把受精卵移植到别的家兔的输卵管，借腹怀孕，最后生出正常的幼兔。为人类IVF-ET的建立奠定了基础。

 英国的生物学家Edwards和妇产科大夫Steptoe共同合作，从20世纪60年代开始就做人类的体外受精研究，1969年他们已经能在体外完成人工受精和培养，在1977年成功地把体外受精的胚胎移植回因为输卵管堵塞不孕的Lesley子宫内，并继续正常发育到足月，终于在1978年7月25日第一个通过体外受精．胚胎移植方法孕育的婴儿louiseBrown诞生。至此人类IVF-ET技术正式建立。

IVF-ET技术的AIH治疗性交障碍;精子在女性生殖道内运行障碍;少、弱症。AID治疗无精症;男方有遗传疾病;夫妻间特殊性血型或免疫不相容。实施AID治疗时，供精者须选择身体健康，智力发育好，无遗传病家族史的青壮年。还须排除染色体变异、乙肝、丙肝、淋病、梅毒，尤其是艾滋病（HIV）。血型要与受者丈夫相同。供精精子应冷冻6个月，复查HIV阴性方可使用 。因HIV的感染有6个月左右的潜伏期，此时诊断不易确定，所以供精精子一般应从精子库获取[3]。按自然周期取卵，将取到的卵泡液注入培养皿，肉眼快速辨认含卵细胞及其外周的透明带、放射冠的卵冠丘复合物。在解剖镜下确认有卵细胞存在后，置入CO 2 培养箱培养4～8h，再根据复合物的形态变化判断选择成熟卵细胞，按每卵配10～20万个精子的比例，投入经过洗涤优选已诱导获能的精子，授精后16～18h观察情况，将受精卵移入培养试管/皿内培养。于取卵后48h，胚胎发育成2～8个细胞阶段或在取卵后72h胚胎发育至8～16个细胞时植入子宫。后者较符合自然受精胚胎进入子宫的时间，且在传统体外培养条件下，只有最健康的胚胎才能活到3天，故移植成功率高。有报道，应用共培养术，可使胚胎培养至囊胚期再移植，妊娠率高达50%。一次移植的胚胎数以2～3枚为宜。因为增加胚胎移植数，妊娠率虽呈不按比例的增加，但多胎率也会随之增加，经对几组移植1～6胎资料的比较，其中以移植3个胚胎的妊娠率相对较高，而多胎率相对较低，最后妊娠。

Iouise Brown被人们称为试管婴儿，试管婴儿的诞生被认为是继心脏移植成功后20世纪医学发展的又一伟大奇迹。随之到来的是全球在发达国家及部分发展中国家的研究试管婴儿热潮，研究人员把这一方法进行了推广、改进和发展。                                                     

1984年Asch建立了配子输卵管移植方法(GIFT)，1986年Ranoux建立了体外受精．阴道培养方法。人们并没有对这些成就所满足，继续更进一步地深入研究，又开辟了显微镜下授精助孕的研究.1988年Gordongn和Talansky首次报道利用生化方法在透明带打孑L使精子进入卵膜受精，后来Cohen在显微镜下采用部分透明带切除(partial zona dissection，PZD)方法解决有些病人精子无法受精的问题。AlanTrounson和Jaeques。Testart两个实验室最先开展PZD，s．CNg进行了透明带下授精(Sulzonal insemination，SUZI)取得了成功。

1992年比利时人Palerl'no在进行ZUZI时不小心把一个精子注入了卵浆内，后来受精了，卵裂正常，他们因此得到了启发，建立了卵浆内单精子注射(intracytoplasmic spermection，ICSI)方法，这一方法是辅助生殖技术的又一重大的进展，特别是在男性不育治疗上更是一个突破性进展，目前在助孕技术中占有突出地位，国外主要的生殖中心ICSI与常规IVF比例大约为1：2或2：3，甚至有更高的比例[7]。

该技术又称第二代试管婴儿，其操作方法是，不用进行精子的诱导获能处理，只须选择一个形态正常，缓慢运动的精子先予以制动。方法用注射针挤压精子尾部，稍微擦破细胞质膜，诱导精子从擦破点释放精子细胞质体因子激活卵细胞，卵细胞的激活对ICSI的正常受精至关重要 ，接着按尾先头后的顺序吸精子放入注射针，再通过显微操作，将精子注入卵胞浆内，即完成受精。其他技术环节同于常规IVF-ET。对精道不通的患者可进行附睾穿刺，如吸出物中无精子，则从睾丸取活组织分离精子，或取精细胞激活后使用。适应证为:严重少、弱畸精症、输精管阻塞、先天性双侧输精管缺如以及输精管结扎后子女伤亡，吻合输精管失败或无法吻合者。

尽管临床上对很大部分病人不育的原因仍难以确切了解，用ICSI治疗效果仍很好。经过近十年的临床应用及研究发现，在IvF治疗中，体外受精率低下及受精失败大部分与精子功能方面缺陷有关，常见的是精子形态、活动力不好、精子与透明带不结合或精子不能穿透等。生精功能低下或障碍的男性不育症，用常规IvF没有较好的治疗效果，由于这些方面的原因促进了ICSI的发展。因而ICSI可以说是转为解决上述男性不育症而发明的治疗方法。：ICSI的发明不仅解决了男性不育治疗难的问题，也为整个临床生育辅助疗法开拓了新的一页。

受精发生是由精子和卵子相互作用自然发生的，ICSI则完全不需要精子有完全正常的功能，男性精子数量的要求也大大降低，从睾丸或附睾内通过手术取得的极少量的精子，甚至单个精子由技术人员挑选后直接注入卵子里也可受精。由于ICSI是人工方法直接刺穿卵细胞膜注入精子授精，因此在注射精子到卵子时有可能把外来的基因物质，如细菌、病毒等同时带入受精卵。对ICSI可能存在的问题目前已引起部分学者的注意。

随着分子生物学的发展，近年来，在人工助孕与显微操作的基础上，胚胎着床前遗传病诊断（PGD）开始发展并用于临床，使不孕不育夫妇不仅能喜得贵子，而且能优生优育。

此法也称第三代试管婴儿，指在IVF-ET的胚胎移植前，取胚胎的遗传物质进行分析，诊断是否有异常，筛选健康胚胎移植，防止遗传病传递的方法人类基因组计划研究的进展、DNA诊断分析技术以及其他技术的不断发展促进了PGD技术迅猛发展。PGD婴儿与ICSI的婴儿相比，新生儿问题或畸形发生率都不高。与常规ICSI分娩的1987个婴儿的情况非常相似，PGD分娩的162个婴儿中单胎占54%、双胎41%、三胎5%。其他指标，如出生体重、身长、头围两组也很相似，主要的异常发生率(2.3%)亦与ICSI组2.9%非常接近。

Trounson等人于1983年报道了利用赠卵IVF-ET技术首例妊娠成功的例子。

与常规IVF-ET相比，技术上供卵IVF-ET要增加两个重要环节，（1）须将受者和供者的月经周期调整同步。方法是，对无卵巢功能的患者，于供者预计月经来潮前3～5天先进行类固醇激素替代治疗（HRT），促进患者子宫内膜产生周期变化，具备接受胚胎着床能力，并诱导内源性LH峰和子宫内膜雌激素受体的产生、改善机体内分泌环境。对有卵巢功能的患者，先用促性腺激素释放激素类似物或增强剂GnRH-A降调节后再用HRT治疗。在HRT治疗周期中，须进行血清激素测定、子宫内膜活检、B超多普勒监测、了解子宫内膜容受性 ［10］ ，以调整给药量，使子宫内膜具有良好容受性。（2）维持妊娠。赠卵与患者丈夫的精子进行体外授精发育和胚胎移植后患者后，须渐增HRT给药。以维持妊娠，直至受者自身胎盘功能建立为止。赠卵IVF-ET妊娠率较高，有的资料报道达44.9%。

人类在针对男性不育的辅助生殖技术上取得的另一大进步是精子的保存技术。

 1962年Sherman发明了液氮蒸气法(1iquid nitrogen vapor)冷冻精子，该方法简化了降温冷冻方法，提高了冻贮的效果。1964年Sherman报道在甘油的保护剂中再加入卵黄冻贮的精子有更高的怀孕率。1974年Sherman用冻贮了123个月的精子作人工授精诞生出健康的婴儿，这证明了长期冻贮精子的可能性，建立人类精子库在技术上已经比较成熟。

无法生育夫妇渴望生育，当有条件生育后，就希望能生育一个健康聪明的后代，在优生优育方面从受精前采取措施是一种很好的途径和发展方向，因此辅助生殖技术进一步发展，会在优生优育方面给以更多的关注。一方面是研究各种辅助生殖技术在优生优育方面能有所作为，另一方面是研究对各种辅助生殖技术对优生优育的影响。也就是说辅助生殖技术不仅仅是为患者助孕，还可对有生育能力的夫妇为了生育一个健康的后代而采用辅助生殖技术，目前在这方面已经开展工作。国内首例运用植入前遗传诊断技术(PGD)的试管婴儿于2000年4月23日在广州中山医科大学诞生，该例的母亲为血友病携带者，运用PGD技术从7个受精发育的胚胎中选择了两个健康的胚胎植入，最后她终于生出一个健康的婴儿。人类对于辅助生殖技术的研究正在紧张的进行中

参考文献：

[1]罗丽兰.不孕与不育.北京:人民卫生出版社,1998.217-227.

[2]张以文 周灿权 等.生殖调控研究及辅助生育技术的进展与方向.中华妇产科杂志

[3]杨青梅.辅助生育技术进展.青海医药杂志,2003,33(2):60-62.

[4]吕军 唐智柳 等.我国人类辅助生殖技术评估概述.中华医院管理杂志,2002,18(10):577-579.

[5]方洁 叶盛.辅助生育技术发展对社会伦理的影响.中国医学伦理学,2003,16(1):26-27. 

[6]叶蓉华 张丽珠.体外受精—胚胎移植后妊娠妇女的产科结局.中华妇产科杂志,:.

[7]王磊光 胥玉梅.应用试管婴儿技术引起的多胎妊娠的危害及预防措施[J].中国妇幼保健,:.

[8]陈元方 邱仁宗.生物医学研究伦理学.北京:中国协和医科大学出版社,2003.180.

[9]寇金矛.辅助生殖技术安全吗.国外科技动态,2003,408(7):24-26.